अनुवांशिक अभ्यास आयोजित करण्याच्या प्रक्रियेत, आम्हाला अनेकदा अपुरे RNA नमुने आढळतात, उदाहरणार्थ, लहान शारीरिक मौखिक ट्यूमरचा अभ्यास करण्यासाठी, अगदी एकल-सेल नमुने आणि विशिष्ट जनुक उत्परिवर्तनांचे नमुने जे मानवी पेशींमध्ये अत्यंत कमी स्तरावर लिप्यंतरण केले जातात.अर्थात, कोविड-19 चाचणीसाठी, जर स्वॅब योग्य ठिकाणी नसेल किंवा सॅम्पलिंग दरम्यान पुरेसा वेळ नसेल, तर नमुन्याचा आकार खूपच कमी असेल, त्यामुळेच दोन दिवसांपूर्वी आरोग्य आणि कुटुंब नियोजन आयोगाने ही माहिती दिली आणि चाचणी उत्तीर्ण झाली आणि जर न्यूक्लिक अॅसिड सॅम्पलरने सहा नमुने घेतले नाहीत तर तुम्ही त्याचा अहवाल देऊ शकता.
अभिकर्मकाची संवेदनशीलता महत्त्वाची आहे कारण आम्हाला ही समस्या आहे किंवा ती समस्या आहे, म्हणून आम्ही RT-PCR ची संवेदनशीलता सुधारण्यासाठी काय करू शकतो?
संभाव्य उपायांवर चर्चा करण्यापूर्वी, आम्ही नुकत्याच नमूद केलेल्या परिस्थितीच्या दोन मोठ्या गुंतागुंतीचा उल्लेख करूया.
सर्वप्रथम, जेव्हा आमच्या नमुन्यात काही पेशींची संख्या असते तेव्हा आम्ही RNA नष्ट होण्याची चिंता करतो.जर पारंपारिक पृथक्करण आणि साफसफाईच्या पद्धती वापरल्या गेल्या, जसे की स्तंभ पद्धत किंवा न्यूक्लिक अॅसिड पर्जन्य पद्धत, काही नमुने नष्ट होण्याची उच्च शक्यता असते.एक उपाय म्हणजे वाहक रेणू जोडणे, जसे की tRNA, परंतु तरीही, आमचा पुनर्प्राप्ती प्रयोग ठीक आहे याची कोणतीही हमी नाही.
तर यापेक्षा चांगला मार्ग कोणता?संवर्धित पेशी किंवा मायक्रोएनाटॉमिकल सॅम्पलसाठी एक चांगला पर्याय म्हणजे डायरेक्ट लिसिस वापरणे.
5 मिनिटांसाठी पेशी विभाजित करणे, आरएनए द्रावणात सोडणे, नंतर 2 मिनिटे प्रतिक्रिया थांबवणे, नंतर लायसेट थेट रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन रिअॅक्शनमध्ये जोडा जेणेकरून कोणताही आरएनए गमावला जाणार नाही आणि शेवटी परिणामी सीडीएनए थेट ठेवा. रिअल-टाइम प्रतिक्रिया मध्ये.
परंतु, मर्यादित प्रारंभ बिंदू किंवा लक्ष्य जनुक अभिव्यक्तीच्या थोड्या प्रमाणात, आपण सर्व आरएनए रीसायकल करू शकतो आणि तरीही एक चांगला रिअल-टाइम सिग्नल मिळविण्यासाठी पुरेसे टेम्पलेट प्रदान करू शकत नसल्यास काय?
या प्रकरणात, प्री-प्रवर्धन चरण खूप उपयुक्त असू शकते.
रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन नंतर संवेदनशीलता वाढवण्याची योजना खालीलप्रमाणे आहे.प्रारंभ करण्यापूर्वी, आम्हाला कोणत्या लक्ष्यांमध्ये स्वारस्य आहे हे आम्हाला डाउनस्ट्रीम विचारण्याची आवश्यकता आहे, जेणेकरुन प्री-एम्प्लीफिकेशनसाठी या लक्ष्यांसाठी विशिष्ट प्राइमर्स डिझाइन करता येतील.
100 जोड्या प्राइमर्ससह मिश्रित प्राइमर आणि 10 ते 14 वेळा प्रतिक्रिया चक्र तयार करून हे साध्य केले जाऊ शकते.म्हणून, प्राप्त केलेल्या सीडीएनएला पूर्व-विवर्धित करण्यासाठी या आवश्यकतेसाठी विशेषतः डिझाइन केलेले मास्टर मिक्स आवश्यक आहे.
10 आणि 14 दरम्यान चक्रांची संख्या सेट करण्याचे कारण असे आहे की ही मर्यादित संख्या चक्र विविध लक्ष्यांमधील यादृच्छिकता सुनिश्चित करते, जे संशोधकांसाठी महत्त्वपूर्ण आहे ज्यांना परिमाणात्मक आण्विक माहिती आवश्यक आहे.
प्री-एम्प्लीफिकेशननंतर, आम्ही मोठ्या प्रमाणात cDNA मिळवू शकतो, ज्यामुळे बॅक-एंडवर शोधण्याची संवेदनशीलता मोठ्या प्रमाणात सुधारली जाते आणि आम्ही नमुना सौम्य करू शकतो आणि संभाव्य यादृच्छिक त्रुटी दूर करण्यासाठी एकाधिक रिअल-टाइम PCR प्रतिक्रिया देखील करू शकतो.
पोस्ट वेळ: एप्रिल-11-2023